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    • 2021-12-25 00:00:00

    Così i “contatti” cellulari riveleranno le malattie

    La scoperta è nata quasi per caso, ma potrebbe rivoluzionare la diagnosi o il trattamento di numerose malattie. Tito Calì e Marisa Brini, rispettivamente professori del Dipartimento di Scienze Biomediche e del Dipartimento di Biologia dell’Università di Padova hanno creato sensori cellulari (Splics) per confermare i risultati ottenuti con altri metodi nel corso di un loro esperimento. Da lì è nato uno strumento utilissimo per rilevare i contatti che avvengono tra un organello e l’altro all’interno di ogni singola cellula.

    Il meccanismo

    Le cellule eucariote sono divise in numerosi compartimenti o organelli. Come gli organi che compongono il corpo umano, anche gli organelli cellulari svolgono funzioni differenti all’interno della cellula. È però la collaborazione e il reciproco interscambio di informazioni, nutrienti, ioni, meta-boliti e lipidi tra gli organelli che garantisce la funzionalità dell’intera cellula.

    Oggi è sempre più diffusa la consapevolezza che numerose malattie, come tumori, diabete e patologie neurodegenerative, si manifestino anche con l’alterazione dei contatti tra ben determinati organelli cellulari. Grazie ai contatti tra due o più organelli la cellula può mettere in atto processi cellulari che non potrebbe esplicare in un singolo organello, perché magari ha bisogno di un enzima contenuto in un altro compartimento. Tramite la formazione o la distruzione di punti di prossimità sica tra le membrane degli organelli differenti, la cellula effettua al proprio interno scambi e comunicazioni tra comparti diversi.

    “Se la suddivisione dei compiti è importantissima per controllare i processi, quando qualcosa non funziona si rischia di compromettere diversi meccanismi nel loro complesso, perché la cellula cerca di attuare risposte di compensazione che a lungo andare si riflettono in una malattia”, spiega Tito Calì. Le malattie neurodegenerative, ad esempio, impiegano anni a manifestarsi perché la cellula non riesce più a compensare i processi alterati. Le interferenze nei contatti tra organelli sono determinanti anche nella definizione dell’aggressività e della capacità meta- statica di un tumore.

    Sensori cellulari per i contatti tra organelli

    Finora era possibile colorare i singoli organelli con coloranti fluorescenti specifici o marcare proteine espresse in un determinato compartimento. Non era invece possibile evidenziare i con- tatti che avvengono tra un organello e l’altro, rilevando anche le reciproche distanze. I ricercatori dell’università di Padova hanno messo a punto sensori capaci di rendere visibili i diversi contatti a livello molecolare.

    “Con tale strumento abbiamo di- mostrato non solo che ci sono diversi contatti, ma anche che si comportano in modo differente. Per esempio, in determinate condizioni metaboliche si verifica che si potenzia un contatto specifico, ma se ne depotenzia un altro”. I sensori che sono stati sviluppati all’Università di Padova sono basati su una proteina già comunemente usata per marcare in modo fluorescente le proteine cellulari: la green fluorescent protein, meglio nota con l’acronimo GFP.

    In questo caso i ricercatori hanno sfruttato una GFP modificata geneticamente, detta splitGFP, perché è divisa in due frammenti che vengono localizzati in due diversi organelli. Nel momento in cui questi si avvicinano tra loro, l’interazione molecolare tra i due frammenti di GFP restituisce le proprietà di fluorescenza alla pro- teina e il punto di contatto diventa luminoso. I frammenti di GFP sono associati artificialmente a frammenti di proteine che sono espresse, anche in natura e in modo esclusivo, in determinati organelli.

    La sfida per i ricercatori era individuare la più pic- cola sequenza della proteina nativa capace di indirizzare la Split GFP proprio nell’organello di interesse. “Non è un’operazione così scontata: per ogni organello target abbiamo dovuto realizzare 10-15 costrutti che differivano per la lunghezza della proteina troncata. Si trattava infatti di trovare un frammento di una lunghezza sufficiente per mandare il co- strutto nell’organello bersaglio, ma al contempo così piccolo da non alterare la fisiologia cellulare”.

    Oggi le Splics sono state ottimizzate anche per visualizzare simultaneamente contatti multipli tra gli organelli della stessa cellula. Inoltre permettono di misurare contatti tra organelli che avvengono a distanze diverse e, grazie a questo, di stabilire una associazione tra la lunghezza del contatto e una speci ca funzione cellulare. I sensori si possono utilizzare sia in vivo che in vitro su cellule, ma anche su modelli di vertebrati come in Zebrafish.

    Verso nuovi farmaci

    La ricerca sulle Splics non è di certo terminata. Gli obiettivi a breve termine riguardano il perfezionamento dei sensori. Dice Calì: “Sono impegnato a studiare sensori che alterino sempre meno la fisiologia cellulare. Inoltre sono felice di avere acquisito una competenza particolare per poter aiutare tutta la comunità scientifica nello sviluppo di nuovi sensori”. Per adesso, infatti, i ricercatori hanno messo a punto i sensori per i contatti tra reticolo endoplasmico e mitocondri, o perossisomi o membrana plasmatica e tra mitocondri e perossisomi. In futuro ci sarà la possibilità di espandere la famiglia dei contatti possibili. Vorremmo con una certa urgenza trovare applicazioni in ambito farmacologico dei sensori”.

    La ricerca di nuovi farmaci può infatti avvantaggiarsi dell’assenza di alterazioni fisiologiche nelle cellule e della possibilità di raccogliere osservazioni in vivo. “Stiamo già compiendo le prime sperimentazioni per lo screening di molecole e composti che modulano una data interfaccia di contatto”. I sensori daranno nuove informazioni circa proteine di cui oggi non si conosce ancora la funzione. “Potrebbero rivelarsi nuovi bersagli di farmaci, cioè proteine “druggable”, perché coinvolte nel mantenimento dell’architettura di un contatto correlato a una patologia” prosegue il professore.

    Infine, anche se non esiste una proteina di contatto legata a una malattia, è stata accertata una correlazione tra le alterazioni di un determinato contatto e la diagnosi di certe patologie. “Fare una sorta di mappatura dei tipi di scambi tra organelli e asso- ciarli a una malattia potrebbe essere davvero utile per e ettuare diagnosi precoci” conclude Calì.

    Un protocollo standard

    I sensori Splics hanno già riscosso grande successo. Molti ricercatori in ambiti diversi hanno iniziato ad utilizzarli per rispondere a differenti quesiti scientifici.

    Lo scambio di informazioni tra tanti gruppi di ricerca è stato importante per perfezionare i sensori e per esplorare nuove applicazioni. Un gruppo della University of Michigan Medical School, ha applicato con successo gli Splics per fare screening di differenti modulatori dei contatti cellulari via FACS.

    La diffusione dei sensori ha però anche fatto emergere la necessità di un protocollo standardizzato per il loro utilizzo. “Leggendo le prime pubblicazioni in cui usavano gli Splics – chiarisce Calì – abbiamo capito che si doveva scongiurare una possibile interpretazione errata della quantificazione delle misure”.

    Anche se gli inventori degli Splics avevano condiviso tutti i dati per la realizzazione dei sensori nella banca dati Addgene, i ricercatori estranei alla tecnica avrebbero dovuto fare molti sforzi per imparare ad utilizzarli con possibili difficoltà di una corretta quantificazione. Spiega ancora il professore: “Al già ampio utilizzo si sono aggiunte tantissime richieste per la fabbricazione di sensori per nuove tipologie di contatto. Per questi due motivi abbiamo considerato la possibilità di pubblicare un protocollo standard, per condividere la nostra esperienza sull’utilizzo del sensore a livello metodologico”.

    Il protocollo è stato recentemente pubblicato su Nature Protocols (Calì and Brini, 2021), a brevissima distanza temporale dai primi articoli sugli Splics risalenti al 2018 ed al 2020. Conclude Calì: “Sono molto orgoglioso del fatto che tante persone abbiano già utilizzato gli Splics, pubblicando articoli su di essi come se fossero una tecnica già consolidata. Inoltre sono ero di ricevere email da università che non possiedono nelle loro facilities strumenti complessi come ad esempio un microscopio elettronico: solo grazie ai nostri sensori hanno potuto condurre i loro esperimenti con strumenti meno sofisticati”.